摘要：利用液相色譜（HPLC）法測定高粱籽粒中阿魏酸、原兒茶醛和花青素的含量，比色法測定總酚、總黃酮、縮合單寧的含量;運用偏小二乘法建立NIR光譜與HPLC法和比色法分析值之間的多元校正模型，預測高粱籽粒中主要酚類物質(zhì)的含量。

1引言

酚類化合物是高粱籽中一種重要的次生代謝物質(zhì)，主要有酚酸、類黃酮及縮合單寧（原花青素）[1]。高粱酚類物質(zhì)不僅是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑 [2]，還具有多種保健功能和藥理作用[3,4]。酚類物質(zhì)的常規(guī)定量檢測方法有化學測定法和高壓液相色譜法[5]。前者分析精度低，無法測定單一酚類物 質(zhì)含量;后者分析精度較高，但是分析過程復雜，速度較慢，且對樣品有化學污染，無法滿足生產(chǎn)過程中在線成分含量監(jiān)控的要求。近紅外光譜技術是一種快速無損 的分析技術，可以在lmin內(nèi)完成物質(zhì)多組分的檢測[6]。近紅外光譜（NIR）主要是有機分子的倍頻與合頻吸收光譜，物質(zhì)分子中的CH，NH，OH和 CO等基團的基頻振動的倍頻與合頻吸收在近紅外區(qū)，因此近紅外技術比較適合于分析與這些基團有直接或間接關系的成分[7]，其突出優(yōu)點是分析速度快、精度 高，穩(wěn)定性好。高粱籽粒中多酚類物質(zhì)都含有的OH，CH，OH，CH2，CHOH及COROH等官能團，在近紅外光譜區(qū)有明顯的吸收。通過化學計量學 的方法建立高粱籽粒多酚類物質(zhì)的近紅外數(shù)學模型，可快速測定高粱籽粒中多酚類物質(zhì)的含量、降低檢測成本。高粱酚類物質(zhì)近紅外預測模型在高粱育種和品質(zhì) 分析中具有廣泛的應用價值。本實驗采用近紅外光譜分析技術定量分析高粱籽粒中多酚類物質(zhì)的含量，并建立了高粱中總酚、總黃酮、縮合單寧、阿魏酸、原兒茶 醛、花青素等酚類物質(zhì)含量的數(shù)學模型，分析精度較高。

2實驗部分

2.1實驗樣品的收集與選擇

實驗材料為山西、遼寧、甘肅、新疆、天津、內(nèi)蒙古等地的33個高粱品種、8個蘇丹草品種及19個高粱蘇丹草雜交品種。所收集材料遺傳源廣、不同材料 間以及籽粒不同部位中單寧含量差異顯著。對60份參試材料種子的不同部位，包括種皮、脫殼籽粒、胚乳、胚以及整粒種子分別進行取樣，終形成300份實驗 樣品。樣品經(jīng)粉碎機（北京六一廠）粉碎，過0.18mm孔徑篩，并經(jīng)CyclotecTM1093型旋風磨（Foss公司）二次粉碎,裝入自封袋,常溫避 光保存,待測。

2.2樣品中6種酚類物質(zhì)的測定

參照文獻[8],采用FolinCiocalteu法測定總酚含量，并略加修改;縮合單寧的測定參照文獻[9]的方法進行;總黃酮的測定參照文獻 [10]的方法并略作修改;使用SHIMADZE10A型液相色譜分析阿魏酸、原兒茶醛和花青素含量，具體步驟參照文獻[11，12]進行。

2.3樣品的光譜測定

AntarisTMFT2NIRAnalyzer光譜測定儀器（美國ThermoNicolet公司）,漫反射積分球附件,旋轉式石英樣品杯（內(nèi)徑 約5cm）。附帶應用軟件為:TQAnalystv6,RESULT2Integration,RESULT2Operation。主要工作參數(shù)為:測量 光譜范圍4000～10000cm-1;掃描次數(shù):64;分辨率:8cm-1;增益:2倍;數(shù)據(jù)形式:log（1/R）。圖16個測定樣品的原始光譜圖

Fig.1Originalspectraofsixtestedsamples

采集光譜前儀器預熱2h。取10～20g高粱籽粒不同部位粉碎樣品盛于直徑50mm的旋轉樣品池中,輕輕搖勻,使表面平整，在上述光譜條件下采集樣 品的吸收光譜。為消除樣品粉碎粒度大小、均勻性不一致等因素對光譜的影響，每個樣品重復掃描3次,每次均掃描背景,計算其平均光譜存于計算機內(nèi)。圖1為所 測定的6個樣品的傅里葉變換近紅外漫反射光譜圖。

2.4模型的建立與驗證

取280份粉碎樣品組成校正集，另取20份粉碎樣品作為驗證集，在適宜的光譜預處理基礎上，運用偏小二乘法（PLS）建立NIR光譜多元校正模 型。本實驗結合多元散射校正（Multiplicativescattercorrection,MSC）和導數(shù)光譜 （Derivativespectra）對NIR光譜進行預處理，用以消除光譜散射效應和基線飄移，通過比較不同波數(shù)范圍和光譜預處理方法對模型的影響， 確立沒食子單寧、原花青素、原兒茶醛、縮合單寧、總黃酮和總酚含量NIR多元校正模型的建模參數(shù)，模型初步建立后，通過TQAnalyst提供的 Leverage診斷功能剔除奇異點，應用交叉驗證法對模型逐步優(yōu)化，進而確定建模的佳主因子數(shù)，并以相關系數(shù)（R）、內(nèi)部交叉驗證均方差 （RMSECV）和校正/預測均方差（RMSEC/RMSEP）作為定量分析模型性能評價指標，同時用RSEC和RSEP來考察模型校正和預測的相對偏 差。

3結果與討論

3.1樣品的選擇及其化學分析結果

本實驗選擇了國內(nèi)廣泛種植的高粱品種、品系共60個,通過種子不同部位取樣，終形成300份樣品，符合所提出的低樣品數(shù)為50個的要求 [13]。表1為儀器測定方法（HPLC法和UV法）所得的6種酚類物質(zhì)在校正集樣品和檢驗集樣品中的分布情況。表1高粱籽樣品中6類酚類物質(zhì)含量測定情 況（mg/g）

3.2模型的優(yōu)化

3.2.1光譜波段的選擇建模波段過寬，必然包含冗余信息，且各成分分子結構存在差異，使得各自對應的優(yōu)建模波段并不相同。因此，波段的選擇 有利于提高模型預測精度。本研究以R和RMSECV值作為評價指標（R值越接近1，RMSECV值越小越優(yōu)）對建模波段進行優(yōu)化，確定6種酚類物質(zhì)各自 佳建模波段，結果見表2。表2NIR光譜建模優(yōu)波段

Wavenumberrange（cm-1）總酚Totalphenol9570.4～4131.0總黃酮 Totalflavone10000～7501.5縮合單寧Proanthocyanidins6000.6～5200.0阿魏酸 Ferulicacid9003.1～4243.0原兒茶醛Protocatechuicaldehyde9716.1～6001.8花青素 Anthocyanins7007.4～6003.33.2.2光譜數(shù)據(jù)預處理實現(xiàn)近紅外光譜分析的前提是采用化學計量學方法建立光譜特征與待測組分之間 的關系。高粱籽粉碎樣品近紅外光譜在4000～10000cm-1譜區(qū)內(nèi)有信息含量豐富的吸收，導致其分析難度相當大。因此，需采用不同的光譜進預處理方 法來消除近紅外漫反射光譜中的隨機誤差和某些系統(tǒng)誤差[14]。

在確定建模波段的基礎上，以R和RMSECV為評價指標，比較NIRS常用的預處理方法，如多元散射校正（MSC）、標準正態(tài)變量校正（SNV）、 導數(shù)光譜（Derivative）以及2種處理方法相結合的方法對模型的影響，結果見表3。由表3可知，對同一組建模樣品集所有待測成分，采用不同的光譜 預處理方法結果均比未進行光譜處理的結果好，但不同的光譜預處理方法之間存在一定的差別，說明不同的光譜預處理方法對模型的精度有一定的影響。對6個測定 組分，用單一光譜預處理方法所得模型的R和RMSECV值的差異均較大，預測效果均不夠;而用多元散射校正與導數(shù)光譜法相結合或標準正態(tài)變量校正與導 數(shù)光譜法相結合的方法，R和RMSECV值均得到顯著改善。以多元散射校正與二階導數(shù)光譜法相結合的方法為優(yōu)，所得模型的誤差較小，故終確立以多元散 射校正與二階導數(shù)光譜法相結合作為預處理方法。表3不同的光譜預處理方法對近紅外模型的影響

3.2.3佳建模主因子數(shù)確定建立多元校正模型需確定佳主因子數(shù)。主因子數(shù)太少將導致模型引入的信息量不足，未能充分反應被測組分產(chǎn)生的光譜變 化，使模型預測度降低，出現(xiàn)模型“欠擬合”現(xiàn)象;而主因子數(shù)過多，又會將一些代表噪音的主成分加到模型中，出現(xiàn)模型“過擬合”，同樣導致模型預測能力 下降[15,16]。本實驗確定的總酚、總黃酮、縮合單寧、阿魏酸、原兒茶醛和花青素6個測定成分佳建模主因子數(shù)分別為4，8，6，6，5和4。

3.3高粱籽中多酚類物質(zhì)近紅外數(shù)學模型的外部驗證

隨機抽取20份已知6種酚類物質(zhì)含量的粉碎樣品，組成檢驗集。用已建立的近紅外數(shù)學模型進行外部檢驗，將預測值與UV測定值和HPLC分析值進行比 較，并繪出對應關系圖，結果見圖2～圖4和表4。NIR光譜預測值與UV測定值和HPLC分析值之間相關性良好，6種酚類物質(zhì)的NIR光譜校正模型相關系 數(shù)R均大于0.97，RSEP控制在8%以內(nèi)，預測回收率在100%～106%之間。以上數(shù)據(jù)說明用近紅外數(shù)學模型預測的度接近其它儀器分析方法，并 能夠滿足酚類物質(zhì)生產(chǎn)過程實時分析的精度要求。校正模型確立后，NIR光譜完成1次測量只需30s（掃描32次），可顯著提高分析效率。

4結論

利用傅里葉變換近紅外透射光譜和偏小二乘法，建立了同時測定高粱籽粒中6種酚類物質(zhì)的方法。校正集樣本的回歸和預測集樣本的驗證結果表明，用近紅 外光譜同時測定高粱籽粒中多種酚類物質(zhì)的方法是可行的，結果。本方法適用于高粱等谷物籽粒多種酚類物質(zhì)同時快速分析。后續(xù)工作應收集具有酚類 化合物含量代表性的高粱樣品，以模型的穩(wěn)定性和可靠性。

結果表明，各成分近紅外預測值與實測值之間的校正模型相關系數(shù)（R）、內(nèi)部交叉驗證均方差（RMSECV）、佳主因子數(shù)分別為：總酚 0.9737，0.288，4;總黃酮0.9660，0.00671，8;縮合單寧0.9558，0.0289，6;阿魏酸 0.9818，0.0391，6;原兒茶醛0.9979，0.0118，5;花青素0.9977，0.0523，4;預測相對偏差（RSEP）分別為：總 酚6.99%、總黃酮4.54%、縮合單寧7.13%、阿魏酸2.68%、原兒茶醛5.46%、花青素5.81%。結果表明，模型對樣品NIR的預測值與 其相應的化學值有較好的相關性，此模型可用來預測高粱籽粒中的各酚類物質(zhì)的含量，在高粱育種和品質(zhì)分析中具有廣泛的應用價值。